style="width:3.38676in;height:0.63338in" /> (1) 本文是学习GB-T 19427-2022 蜂胶中12种酚类化合物含量的测定 液相色谱-串联质谱法和液相色谱法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本文件描述了蜂胶中咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、槲皮素、获菲醇、芹菜素、松属素、柯因、高良姜素、
短叶松素3-乙酸酯、绿原酸、阿替匹林C
含量测定的液相色谱-串联质谱法和液相色谱法。
本文件适用于蜂胶中咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、槲皮素、获菲醇、芹菜素、松属素、柯因、高良姜素、
短叶松素3-乙酸酯、绿原酸、阿替匹林C 含量的测定。
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件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
本文件没有需要界定的术语和定义。
蜂胶试样用85%乙醇水溶液提取，超声、离心、过滤和定容后，液相色谱-串联质谱仪测定或配有紫
外检测器的液相色谱仪测定，外标法定量。
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。
5.5 乙醇水溶液(85+15):准确移取85 mL 乙醇(5.1)至100 mL
容量瓶中，用水定容。
5.6 甲醇水溶液(80+20):准确移取80 mL 甲醇(5.2)至100 mL
容量瓶中，用水定容。
5.7 甲醇-0.1%甲酸水溶液(50+50):准确移取50 mL 甲醇(5.2)以及0.1 mL
甲酸(5.3)至100 mL 容 量瓶中，用水定容。
5.8 0.1%甲酸水溶液：准确移取1.0 mL 甲酸(5.3)至1000 mL
容量瓶中，用水定容。
5.9 0.1%甲酸-甲醇溶液：准确移取1.0 mL 甲酸(5.3)至1000 mL
容量瓶中，用甲醇(5.2)定容。
5.10 1.0%乙酸水溶液：准确移取10 mL 乙酸(5.4)至1000 mL
容量瓶中，用水定容。
GB/T 19427—2022
5.11 标准物质：绿原酸(CAS 号：327-97-9)、咖啡酸(CAS
号：331-39-5)、p- 香豆酸(CAS 号：501-98-4)、 阿魏酸(CAS
号：1135-24-6)、槲皮素(CAS 号：117-39-5)、获菲醇(CAS
号：520-18-3)、芹菜素(CAS 号 ： 520-36-5)、松属素(CAS
号：480-39-7)、短叶松素3-乙酸酯(CAS 号：52117-69-8)、柯因(CAS
号：480-40-0)、 高良姜素(CAS 号：548-83-4)和阿替匹林C(CAS
号：72944-19-5),纯度均不低于98%。
5.12
标准储备液：准确称取适量的标准物质(5.11),分别用甲醇(5.2)制备浓度为1.0
mg/mL 的标准 储备液，该储备液在-18℃及以下温度可稳定保存6个月。
5.13
标准工作溶液：移取适量的标准储备液(5.12),用甲醇-0.1%甲酸水溶液(5.7)稀释成浓度为
0.02 μg/mL、0.05
μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL的混合标准工作溶液，供液
相色谱-串联质谱法检测使用；移取适量的标准储备液(5.12),用甲醇水溶液(5.6)分别稀释成浓度为
1.0
pg/mL、2.0μg/mL、5.0pg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的混合标准工作溶液，供液
相色谱-紫外检测法检测使用。
6.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。
6.2 液相色谱仪：配有紫外(或二极管阵列)检测器。
6.3 分析天平：感量0.01 mg 和0.001 g。
6.5 离心机：转速不低于4000 r/min。
6.6 微量可调移液器：量程分别为10μL～100μL 和0.1 mL～1mL。
取混合均匀的代表性蜂胶样品约100
g,密封，并做标记。在样品测定前，将被测样品放入10℃以 下冰箱中保持2 h
后，取出20 g～30g, 迅速用粉碎机粉碎，过孔径约为2 mm(10
目)的筛，冷藏保存于
冰箱中作为待测试样。
称取0.5 g (精确至0.001 g)试样于50 mL 塑料离心管中，加15 mL
乙醇水溶液(5.5),在室温超声 提取20 min, 在4000 r/min 下离心10 min,
上清液转入50 mL 容量瓶中，按照上述步骤重复提取离心
2次，合并上清液，用乙醇水溶液(5.5)定容至50 mL,
混匀。取上述样品溶液用甲醇水溶液(5.6)适当稀 释并混匀后，取部分溶液过0.22
μm 微孔滤膜(6.7)至样品瓶中，供液相色谱仪(6.2)测定；或取上述样
品溶液用甲醇-0.1%甲酸水溶液(5.7)适当稀释后，过0.22 μm
微孔滤膜(6.7)至样品瓶中，供液相色谱-
串联质谱仪(6.1)测定。
液相色谱-串联质谱仪的液相色谱参考条件如下：
a) 色谱柱：C18,100mm×2.1 mm;1.7μm 或相当者；
GB/T 19427—2022
b) 流动相 A:0.1% 甲酸水溶液(5.8);
c) 流动相B:0.1% 甲酸-甲醇溶液(5.9),梯度洗脱条件参见附录A 的表 A.1;
d) 流速：0.25 mL/min;
e) 柱温：30℃;
f) 进样体积：2μL。
液相色谱-串联质谱仪的质谱参考条件如下：
a) 扫描方式：正负离子扫描；
b) 检测方式：多离子反应监测(MRM);
c) 电喷雾电压：+5500 V/—4500 V;
d) 雾化气体气压：0.345 MPa;
e) 气帘气压：0.172 MPa;
f) 离子源温度：500℃;
g) 去簇电压：+100 V/—100 V;
h) 定量离子对、定性离子对和碰撞能量：参见表1。
液相色谱仪(6.2)的参考条件如下：
a) 色谱柱：C18,150mm×4.6 mm;3.0 μm 或相当者；
b) 流动相 A:1.0% 乙酸水溶液(5.10);
c) 流动相B: 甲醇(5.2),梯度洗脱条件参见表 A.2;
d) 流速：1.0 mL/min;
e) 柱温：35℃;
f) 进样体积：5μL;
g) 检测波长：12种酚类化合物的定量检测波长参见表1。
表 1 HPLC-MS/MS
离子化模式、定量离子对、定性离子对、碰撞能量及 HPLC-UV
检测波长
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GB/T 19427—2022
7.2.3.1 液相色谱-串联质谱法
按7.2.1中液相色谱-串联质谱分析条件，分别测定样品溶液和混合标准工作溶液(5.13)。如果样
品溶液与标准工作溶液在相同的保留时间有峰出现(保留时间偏差不超过士2.5%),且在扣除背景后的
样品谱图中，所选择离子全部出现，其离子的丰度与标准物质对应的离子丰度一致，相对离子丰度偏差
不超过表2的规定范围，可判定样品中存在被测物。以标准工作溶液浓度为横坐标，以12种酚类化合
物定量离子峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。样品溶液中12种酚类化合物的响应值均应在仪器测
定的线性范围内。12种酚类化合物的多反应监测(MRM)
色谱图和保留时间参见附录 B 的 图 B. 1。
表 2 定性测定中相对离子丰度的最大允许偏差
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7.2.3.2 液相色谱法
按7.2.2中液相色谱分析条件，分别测定样品溶液和混合标准工作溶液。如果样品溶液与混合标
准工作溶液在相同的保留时间有峰出现(保留时间偏差不超过士2.5%),可判定样品中存在被测物。以
标准工作溶液浓度为横坐标，以定量检测波长下12种酚类化合物峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。
样品溶液中12种酚类化合物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。12种酚类化合物标准物质的色
谱图和保留时间参见图 B.2。
同一样品应按照7. 1和7.2进行平行测试。
不称取试样，其余均按照7.1和7.2进行。
某一种酚类化合物在试样中的含量用色谱数据处理系统或用式(1)计算：
style="width:3.38676in;height:0.63338in" /> (1)
式中：
X— 试样中酚类化合物含量，单位为克每千克(g/kg);
c —
从标准工作曲线得到的试样溶液中各目标物质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
V— 试样溶液定容体积，单位为毫升(mL);
m—— 最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克(g)。
计算结果保留三位有效数字。
本文件液相色谱-串联质谱法的定量限：绿原酸、咖啡酸、p-
香豆酸、阿魏酸、槲皮素、获菲醇、芹菜
GB/T 19427—2022
素、松属素、短叶松素3-乙酸酯、柯因、高良姜素和阿替匹林 C 均为0.02 μg/mL;
按照1:10000稀释倍
数计算，方法对于实际样品中绿原酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、槲皮素、获菲醇、芹菜素、松属素、短叶
松素3-乙酸酯、柯因、高良姜素、阿替匹林C 定量限均为0.20 g/kg。
本文件液相色谱法的定量限：绿原酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、槲皮素、获菲醇、芹菜素、松属素、
短叶松素3-乙酸酯、柯因、高良姜素、阿替匹林C 均为1.0μg/mL;
按照1:100稀释倍数计算，方法对于
实际样品中绿原酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、槲皮素、获菲醇、芹菜素、松属素、短叶松素3-乙酸酯、柯
因、高良姜素、阿替匹林C 定量限均为0.10 g/kg。
平行试验两次测定的绝对差值不超过其算术平均值的10%。
GB/T 19427—2022
(资料性)
液相色谱-串联质谱法和液相色谱-紫外检测法梯度洗脱条件
液相色谱-串联质谱法和液相色谱-紫外检测法的梯度洗脱条件分别见表 A.1
和表 A.2。
表 A.1 液相色谱-串联质谱法梯度洗脱条件
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表 A.2 液相色谱法梯度洗脱条件
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style="width:5.27995in;height:2.67322in" />GB/T 19427—2022
(资料性)
12种酚类化合物标准的多离子反应监测(MRM)
色谱图和 HPLV-UV 色谱图
12种酚类化合物标准的多离子反应监测(MRM)
图 B.2。
色 谱 图 和 HPLV-UV 色 谱 图 分 别 见 图 B.1 和
style="width:5.34666in;height:2.6466in" />
a) 绿原酸定量离子对色谱图
style="width:5.31991in;height:2.56014in" />
c ) 咖 啡 酸 定 量 离 子 对 色
谱 图
style="width:5.3067in;height:2.5465in" />
e) p-香豆酸定量离子对色谱图
style="width:5.39339in;height:2.6466in" />
g) 阿魏酸定量离子对色谱图
b) 绿原酸定性离子对色谱图
4.58
v 2. 0 5
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d) 咖啡酸定性离子对色谱图
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f) p-香豆酸定性离子对色谱图
style="width:5.3067in;height:2.57994in" />
h) 阿魏酸定性离子对色谱图
图 B.1 12 种酚类化合物的多离子反应监测色谱图
style="width:5.39999in;height:2.6334in" />GB/T 19427—2022
style="width:5.31991in;height:2.54672in" />
i) 槲皮素定量离子对色谱图
style="width:5.3067in;height:2.5399in" />
j) 槲皮素定性离子对色谱图
style="width:5.35327in;height:2.64in" />
k) 获菲醇定量离子对色谱图 1) 获菲醇定性离子对色谱图
style="width:5.35327in;height:2.61998in" />
m) 芹菜素定量离子对色谱图
style="width:5.23999in;height:2.44002in" />
n) 芹菜素定性离子对色谱图
style="width:5.32668in;height:2.60656in" />
o) 松属素定量离子对色谱图 p) 松属素定性离子对色谱图
T
7.8e6
7.0e6-
6.0c6
Q…s
3.0e6-
2.0e6
1.0e6
0.0:
9.35
312.7/253.0
t/min
q) 短叶松素3-乙酸酯定量离子对色谱图 r) 短叶松素3 -
乙酸酯定性离子对色谱图
图 B.1 12 种酚类化合物的多离子反应监测色谱图 ( 续 )
GB/T 19427—2022
style="width:5.3067in;height:2.55332in" />
s) 柯因定量离子对色谱图
style="width:5.33328in;height:2.61998in" />
u) 高良姜素定量离子对色谱图
style="width:5.3133in;height:2.59996in" />
style="width:5.23338in;height:2.58558in" />
t) 柯因定性离子对色谱图
style="width:5.32668in;height:2.6268in" />
v) 高良姜素定性离子对色谱图
style="width:5.3133in;height:2.60656in" />
w) 阿替匹林C 定量离子对色谱图 x) 阿替匹林C 定性离子对色谱图
图 B.1 12 种 酚 类 化 合 物 的
多 离 子 反 应 监 测 色 谱 图
( 续 )
GB/T 19427—2022
12种酚类化合物标准的 HPLV-UV 色谱图如图 B.2。
style="width:10.89329in;height:4.80678in" />
标引序号说明：
1——绿原酸，3.14 min;
2——咖啡酸，4.67 min;
4——阿魏酸，9.09 min;
5——槲皮素，17.22 min;
6——获菲醇，22.05 min;
7—-芹菜素，23.02 min;
8——松属素，28.76 min;
9 短叶松素3-乙酸酯，29.44 min; 10——柯因，30.45 min;
11——高良姜素，32.00 min;
12——阿替匹林C,38.97 min。
图 B.2 12 种酚类化合物的 HPLC-UV 色谱图
更多内容 可以 GB-T 19427-2022 蜂胶中12种酚类化合物含量的测定 液相色谱-串联质谱法和液相色谱法. 进一步学习